【產(chǎn)品簡(jiǎn)介】

Haoke^? Universal Transfection Reagent是一種多用途的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，用于向幾乎所有常見(jiàn)細(xì)胞系和多種難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中進(jìn)行DNA、siRNA和mRNA的轉(zhuǎn)染。并支持快速轉(zhuǎn)染程序，可以縮短您的轉(zhuǎn)染時(shí)間，適配高通量、自動(dòng)化篩選。

【儲(chǔ)存方式】

2-8oC保存，不可冷凍。

【使用方法】

操作前注意事項(xiàng)

1. 為降低細(xì)胞毒性，細(xì)胞鋪板時(shí)需要更換不含抗生素的培養(yǎng)基。對(duì)于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，細(xì)胞密度需達(dá)到70-90%，有些細(xì)胞在密度偏低時(shí)容易出現(xiàn)細(xì)胞毒性；
2. 制備核酸稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液時(shí)應(yīng)使用減血清的Opti-MEM?培養(yǎng)基或不含血清和抗生素的培養(yǎng)液，因?yàn)檠鍟?huì)影響核酸與轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物的形成；
3. 一般情況下，轉(zhuǎn)染后無(wú)需更換培養(yǎng)基。然而，有些細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染試劑比較敏感，如果在轉(zhuǎn)染后狀態(tài)不佳，可在 4-6小時(shí)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，轉(zhuǎn)染效率無(wú)明顯影響；
4. 首次使用該試劑或者更換細(xì)胞類型，特別是對(duì)轉(zhuǎn)染試劑敏感的細(xì)胞，需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，使用不同劑量的轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以便摸索出最適轉(zhuǎn)染試劑用量。DNA的轉(zhuǎn)染量可以在DNA：Universal Transfection Reagent?(μg/μL）=1:1-1:5 之間摸索。
5. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套；
6. 本產(chǎn)品僅用于科研。

操作步驟

一、DNA 轉(zhuǎn)染

（以24孔板轉(zhuǎn)染DNA為例的操作步驟）

Day 1：

在500 μL不含抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鋪板，使得轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞匯合度達(dá)到70-90%。

Day 2：

1. DNA 稀釋液制備: ?取1個(gè)干凈的 1.5 mL 離心管，?向25 μL Opti-MEM?培養(yǎng)基中加入 0.5 μg?DNA 后輕柔混勻，得到 DNA 稀釋液；
2. 轉(zhuǎn)染試劑稀釋液制備:另取1個(gè)干凈的1.5?mL離心管，向25?μL?Opti-MEM?培養(yǎng)基中加入1?μL?Universal Transfection Reagent，輕柔混勻，得到轉(zhuǎn)染試劑稀釋液，室溫靜置5分鐘；
3. DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備：將DNA?稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液混合，輕柔混勻，室溫靜置10分鐘，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物（溶液可能變得渾濁）；
4. 將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物均勻滴加入細(xì)胞中，以十字交叉的方式進(jìn)行輕柔混勻。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，為保證足夠的營(yíng)養(yǎng)，建議4-6h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，隨后繼續(xù)培養(yǎng)至鑒定時(shí)間，一般需要24-48?h。

優(yōu)化 DNA 轉(zhuǎn)染：為獲得較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，通過(guò)改變細(xì)胞密度以及 DNA 和Universal Transfection Reagent濃度來(lái)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。確保細(xì)胞匯合度大于 90%，并在1:0.5至1:5的范圍內(nèi)改變DNA (μg) :Universal Transfection Reagent (μL)比。

二、siRNA 轉(zhuǎn)染

（以 24 孔板轉(zhuǎn)染 siRNA 為例的操作步驟）

Day 1 ：:

在500 μL不含抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鋪板，使得轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞匯合度達(dá)到 30-50%。注：在更低密度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以讓轉(zhuǎn)染和檢測(cè)之間的時(shí)間間隔更長(zhǎng)，并且使因細(xì)胞過(guò)量生長(zhǎng)造成的細(xì)胞活力損失更小。

Day 2：

1. 將siRNA的儲(chǔ)液用DEPC水稀釋到20 μM；
2. siRNA 稀釋液制備：取1個(gè)干凈的1.5?mL離心管，?向25?μL Opti-MEM?培養(yǎng)基中加入?1?μL siRNA（20μM）后輕柔混勻，得到 siRNA 稀釋液；
3. 轉(zhuǎn)染試劑稀釋液制備：另取1個(gè)干凈的1.5?mL離心管，?向25?μL?Opti-MEM??培養(yǎng)基中加入1?μL?Universal Transfection Reagent，輕柔混勻，得到轉(zhuǎn)染試劑稀釋液，室溫靜置5分鐘。
4. siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備：將siRNA 稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液混合，輕柔混勻，室溫靜置 10 分鐘，形成 siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物（溶液可能變得渾濁）；
5. 將 siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物均勻滴加入細(xì)胞中，以十字交叉的方式進(jìn)行輕柔混勻。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，為保證足夠的營(yíng)養(yǎng)，建議4-6?h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，隨后繼續(xù)培養(yǎng)至鑒定時(shí)間，一般需要48-96?h。

優(yōu)化siRNA轉(zhuǎn)染：為獲得較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的非特異性效應(yīng)，通過(guò)改變siRNA和Universal Transfection Reagent濃度來(lái)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。對(duì)于24 孔板，在10-50 pmol siRNA和0.5-1.5 μL Universal Transfection Reagent范圍內(nèi)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。根據(jù)靶基因和靶細(xì)胞的性質(zhì)，在優(yōu)化條件時(shí)也可考慮以更高密度轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

三、mRNA 轉(zhuǎn)染

（以 24 孔板轉(zhuǎn)染 mRNA 為例的操作步驟）

Day 1：

在500 μL不含抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鋪板，使得轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞匯合度達(dá)到70-90%。

Day 2：

1. mRNA 稀釋液制備：取1個(gè)干凈的1.5?mL離心管，?向25 μL?Opti-MEM?培養(yǎng)基中加入 0.8 μg mRNA 后輕柔混勻，得到 mRNA 稀釋液；2.?轉(zhuǎn)染試劑稀釋液制備：另取1個(gè)干凈的1.5 mL離心管，向25 μL?Opti-MEM?培養(yǎng)基中加入1.6 μL?Universal Transfection Reagent，輕柔混勻，得到轉(zhuǎn)染試劑稀釋液，室溫靜置5分鐘；

3. mRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備：將 mRNA 稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液混合，輕柔混勻，室溫靜置10分鐘，形成 mRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物（溶液可能變得渾濁）；

4. 將mRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物均勻滴加入細(xì)胞中，以十字交叉的方式進(jìn)行輕柔混勻。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，為保證足夠的營(yíng)養(yǎng)，建議4-6 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，隨后繼續(xù)培養(yǎng)至鑒定時(shí)間，一般需要24-48 h。

優(yōu)化 mRNA 轉(zhuǎn)染：為獲得較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，通過(guò)改變細(xì)胞密度以及 mRNA 和Universal Transfection Reagent濃度來(lái)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。確保細(xì)胞匯合度大于 90%，并在1:0.5 至1:5的范圍內(nèi)改變mRNA (μg) : Universal Transfection Reagent (μL) 比。

擴(kuò)大或縮小轉(zhuǎn)染規(guī)模

在不同規(guī)格培養(yǎng)容器中轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按表中所示根據(jù)相對(duì)表面積按比例改變Universal Transfection Reagent、核酸、細(xì)胞和培養(yǎng)基的用量。對(duì)于自動(dòng)化、高通量系統(tǒng)，在96孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，建議采用10 μL的稀釋體積。

培養(yǎng)規(guī)格	培養(yǎng)基體積	稀釋液體積	DNA 轉(zhuǎn)染體系		siRNA 轉(zhuǎn)染體系		mRNA 轉(zhuǎn)染體系
			DNA	Transfection Reagent	siRNA	Transfection Reagent	mRNA	Transfection Reagent
96-well	100 μL	2 × 5 μL	0.1μg	0.2 μL	5 pmol	0.25 μL	0.2 μg	0.4 μL
24-well	500 μL	2 × 25 μL	0.5 μg	1.0 μL	20 pmol	1.0 μL	0.8 μg	1.6 μL
12-well	1 mL	2 × 50 μL	1.0 μg	2 μL	40 pmol	2.0 μL	1.6 μg	3.2 μL
6-well	2 mL	2 × 100 μL	2.5 μg	5 μL	100 pmol	5 μL	4 μg	8 μL
6-cm dish	3 mL	2 × 200 μL	5 μg	10 μL	200 pmol	10 μL	8 μg	16 μL
10-cm dish	10 mL	2 × 500 μL	15 μg	30 μL	600 pmol	30 μL	24 μg	48 μL

四、DNA、siRNA / shRNA 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染

（以 24 孔板共轉(zhuǎn)染 DNA、siRNA 為例的操作步驟）

Day 1：

在500 μL不含抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鋪板，使得轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞匯合度達(dá)到70-90%。

Day 2：

1. 建議將 siRNA 的儲(chǔ)液用DEPC水稀釋到2?μM（視情況而定）；
2. 核酸稀釋液制備：取1個(gè)干凈的 1.5 mL 離心管，向 25 μL?Opti-MEM?培養(yǎng)基中加入 100 ng 質(zhì)粒 DNA 和2.5 μL?siRNA（2?μM）后輕柔混勻，得到核酸稀釋液；
3. 轉(zhuǎn)染試劑稀釋液制備：另取1個(gè)干凈的1.5?mL離心管，向25 μL?Opti-MEM?培養(yǎng)基中加入 1?μL Universal Transfection Reagent?，輕柔混勻，得到轉(zhuǎn)染試劑稀釋液，室溫靜置5分鐘。
4. 核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物制備：將核酸稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液混合，輕柔混勻，室溫靜置10分鐘，形成核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物（溶液可能變得渾濁）；
5. 將核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物均勻滴加入細(xì)胞中，以十字交叉的方式進(jìn)行輕柔混勻。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，為保證足夠的營(yíng)養(yǎng)，建議4-6 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，隨后繼續(xù)培養(yǎng)至鑒定時(shí)間，一般需要24-48?h。

建議的試劑用量和體積：

培養(yǎng)規(guī)格	培養(yǎng)基體積	稀釋液體積	質(zhì)粒 DNA(ng)	siRNA / shRNA 質(zhì)粒(pmol / ng)	Transfection Reagent
96-well	100 μL	2 × 5 μL	10-100 ng	0.1-1 pmol / 150-300 ng	0.2-0.5 μL
48-wel	200  μL	2 × 12.5 μL	50-100 ng	0.5-5 pmol / 150-300 ng	0.3-0.8 μL
24-well	500 μL	2 × 25 μL	100-200 ng	1-10 pmol / 300-600 ng	0.5-1.5 μL
12-well	1 mL	2 × 50μL	200-500 ng	2-25 pmol / 600-1500 ng	1-2.5 μL
6-well	2 mL	2 × 200 μL	500-1000 ng	5-50 pmol / 1500-3000 ng	2.5-6 μL